激光共聚焦扫描显微镜（CLSM），作为20世纪80年代崭露头角的高精度成像利器，已然成为研究亚微米结构不可或缺的科研重器。得益于计算机技术的飞速进步、图像处理软件的日益成熟以及激光器的创新发展，共焦显微镜不断迎来革新与突破，现已广泛涉足生物学、微系统以及材料测量等诸多领域，展现出其强大的应用潜力。共焦显微镜，这一集共焦原理、精密扫描技术和先进计算机图形处理技术于一身的新型显微镜，不仅具备卓越的横向分辨率，更拥有出色的轴向分辨率。它巧妙地抑制了杂散光的干扰，确保图像对比度的高标准。正因如此，共焦显微镜在科研领域中备受青睐，为研究者们提供了前所未有的观察与测量手段，助力他们在微观世界中探寻真理的奥秘。

典型的共焦显微镜装置设计精妙，它在被测对象的焦平面共轭位置上巧妙设置了两个小孔，分别位于光源前端与探测器前端，正如图示所示。从图中我们可以观察到，当被测样品恰好位于准焦平面上时，探测端所接收到的光强达到峰值；而当样品偏离焦平面时，探测端的光斑会发生弥散现象，光强则迅速衰减。这一设计原理确保了仅有焦平面上的点所发出的光线能够透过出射针孔，而焦平面以外的点所发出的光线，在出射针孔平面上呈现为离焦状态，大部分光线无法穿越中心针孔。因此，焦平面上的观察目标点会以亮色呈现，而非观察点则作为背景以黑色展现，从而大大增强了图像的对比度，同时赋予了共聚焦显微镜控制景深的能力、消除或减少焦平面的背景信息（高信噪比）的能力以及从厚标本收集连续光学切片的能力。

在共焦显微镜中，探测器处的针孔大小起到了至关重要的作用。它直接关乎系统的分辨率与信噪比。若针孔过大，则无法有效发挥共焦点探测的作用，不仅会降低系统的分辨率，还会引入更多的杂散光；而针孔过小，则会导致探测效率降低，显微图像的亮度也会相应减弱。研究表明，当针孔直径恰好等于艾里斑的直径时，既能满足共焦要求，又不会显著影响探测效率。由于针孔的直径通常处于微米量级，因此激光束的会聚焦点与针孔位置之间的任何微小偏差，都可能导致信号失真。因此，共焦显微镜普遍采用自动对焦系统，以确保测量的准确性，但这也无形中增加了测量所需的时间。

激光共聚焦显微镜利用单色激光扫描束通过照明针孔形成点光源，对标本内焦平面上的每一点进行逐点扫描。在扫描过程中，标本上的被照射点在检测器的检测针孔处成像，由检测针孔后的光电倍增管逐点或逐线接收，然后迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。这种逐点扫描的方式能够精确地获取标本的每一个细节，与传统的宽视野显微镜技术相比，共焦显微镜的分辨率显著提升。由于激光扫描显微镜的分辨率取决于物镜的数值孔径(NA)，因此使用高NA物镜来实现高分辨率图像至关重要。

共聚焦显微镜的应用领域广泛，包括生物化学、药理学、生理学、发育生物学、遗传学和组胚学、神经生物学、微生物学和寄生虫学，以及病理学及病理学临床应用等。例如，在生物化学中，共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变得更加简单、准确。相比普通显微镜具有诸多优点，如散射背景小、信噪比低、成像质量好，可进行三维扫描成像，成像系统的色差小，对细胞的伤害也非常小，适合进行活细胞内的细微结构的成像。

总的来说，共聚焦显微镜以其独特的工作原理和优势，为科学研究和临床应用提供了强有力的工具，促进了各个领域的进步和发展。